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PCR实验室是如何将新冠病毒检测出来的?

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新型冠状病毒肺炎又称“2019-nCoV“,是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难。你知道新冠病毒是如何检测的吗?

 

一、认识冠状病毒

 

冠状病毒是一个大型病毒家族,因该病毒形态在电镜下观察类似王冠而得名。目前为止发现,冠状病毒仅感染脊椎动物,可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病,如感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。

 

 

众所周知,新型冠状病毒潜伏期为14天,当出现呼吸困难、乏力、高烧等现象,应当尽早报备相关机构,尽早提取标本进行检验筛查。相信大家都很好奇,新冠病毒是如何被检测出来的呢?

 

二、新冠病毒核酸检测流程

 

采取咽拭子样本,送到检验医学中心,实验室内会为核酸检测准备4个区域,分别是试剂准备区、样本准备区、扩增区、扩增产物分析区。

 

其中试剂准备区负责接收患者样本,样本准备区则负责进行对样本的核酸进行提取,扩增区则是扩增复制核酸样本,扩增后分析区就是分析样本内核酸能能否与标准样配对,通过仪器检测的到,就判断成阳性,如果检测不到就是阴性。

 

三、认识PCR实验室

 

PCR(聚合酶链式反应)实验室又叫基因扩增实验室,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统,能迅速掌握患者体内的病毒含量,其精确度高达纳米级别,精确检测新型冠状病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据。

 

PCR实验室分类:普通PCR实验室、全自动定量PCR实验室、一体自动化分析PCR实验室。

 

四、PCR实验室的四个分区

 

01、试剂准备区

 

功能作用:试剂准备区是PCR实验室中最为“洁净”的区域,它不应有任何核酸成分的存在,否则将严重影响检测结果的准确性。标本的制备应在生物安全柜内进行。

 

主要设备:冰箱、低温冰箱、混匀器、微量加样器(0.2-1000ul)、移动紫外灯。

 


02、样本准备区

 

功能作用:核酸提取、贮存,扩增反应管制作。

 

主要设备:冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机、混匀器、微量加样器(0.2-1000ul)、移动紫外灯、水浴锅、生物安全柜。

 

03、扩增区

 

功能作用:扩增反应体系的配置和核酸的提取加入要在扩增区内进行。

 

主要设备:扩增仪、离心机、微量加样器(0.2-1000ul)、移动紫外灯。

 

生物安全柜内操作

 

04、扩增产物分析区

 

功能作用:产物分析区最后一个工作区域,用于扩增片段的分析,由于本工作区域应设置为负压状态,空气流向为由外向内,以防止扩增产物的气溶胶的流出(一般四个分区皆设置缓冲间)。

 

主要设备:凝胶成像分析仪、电泳仪、电泳槽、微量加样器(0.2-1000ul)、移动紫外灯。

 

即:试剂准备区→样本准备区→扩增区→扩增产物分析区。

 

PCR 实验室的各个实验区域之间应形成单向工艺流、物流、人流与气流,实现单向流程的屏障保护。通过严格的单向流线,避免实验之间的相互干扰和交叉污染,防止核酸气溶胶对实验过程造成污染,产生假性结果。

 

避免交叉感染

 

PCR实验室的气流压差原理及控制:

 

1、试剂准备区是工艺流线的开始,设计为正压或常压,避免外界环境的污染。

 

2、样品准备区一般为常压或负压,大多数情况下设计成二级生物安全实验室,避免实验产物溢出,污染外界环境。

 

3、扩增区为负压,避免实验产物溢出,污染外界环境。

 

4、扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,通常压力设计为最低,避免实验产物溢出,污染外界环境。

 

供参考

 

五、PCR实验室的设计

 

PCR实验室的送排风设计及排放准则:

 

1、气流组织宜采用上送下排;

 

2、生物安全柜上方不得设计送风口;

 

3、高效过滤排风口应设计在实验室内污染最严重的区域,且为单向;

 

4、不得循环送排风。

 

PCR实验室排风应有效处理达标后在2m以上高空进行排放。

 

怎么定义为阳性?

 

20世纪70年代以来,国际上统一了冠状病毒的命名,了解了病毒的基因结构和部分功能,研究出好几种可识别病毒生长的指标,只有定下指标,才能检测你是阳性阴性。

 

那么“新冠病毒”是怎么被定义为阳性的?

 

“新冠病毒阳性”要确认这一点,必须从样本(比如痰、汗液、血液、粪便等等)里提取出完整的病毒。在这次疫情暴发之初,我们有听到一些新闻所谓“分离出病毒株”,大概指的就是这个。

 

这个操作挺麻烦的,并且不是每一次都能分离成功。只能作为“确实有病毒在这里”的绝对证据。但作为给患者的检测,既慢,又不够准确。因此,现在我们听到更多的,是“新冠病毒核酸检测阳性”。

 

所谓“新冠病毒核酸检测阳性”,又是怎么来的呢? 首先,提取样本。就是把痰啊、咽拭子采到的东西啊、粪便啊等等,先想办法收起来,拿到实验室把样本里面的核酸(就新冠病毒而言,指RNA)提取出来。RNA提取之后,降解速度非常快。因此,其实我们需要把RNA再对应的转成为cDNA。

 

接下来的过程,本质叫做PCR(聚合酶链式反应)。大致意思就是用特别的标签,把新冠病毒最特征的那一段信息(原本是RNA信息,此时已经对应转换成为cDNA信息)给识别出来。不只是识别,这个过程是在识别的基础上,反复的复制这一段。那么经过一段时间,原来在样本里只有一点点的信息,就被扩增到很多了,也就容易查到了。

 

 

检测用到的,叫做realtimePCR。啥意思呢?就是说病毒的核酸信息每一次被复制都会被记录下来。这样检测更准确。并且,理论上说,甚至可以推断出样本里面的病毒核酸的密度。

 

如果样本里面没有病毒核酸,那么那个寻找病毒信息的标签,就永远也找不到落点。这时候当然不可能有任何东西被复制出来,那么检测结果就是阴性。

 

如果样本里面有病毒核酸,那么标签就可以找到它,并且复制它,然后发出信号告诉检测者:这里有病毒。这,就是核酸检测阳性。

 

然而,当样本里的病毒核酸数量特别少的时候,标签可能找不到……这就会造成检测的假阴性。

 

如果标签的灵敏度不够,也会出现找不到病毒核酸的情况。这也会造成检测的假阴性。某些患者检测若干次都是阴性,最后才发现是阳性。

简单来说,就是有可能是取样的时候没有取到病毒最多的地方,或者当时患者体内的病毒确实不多,或者检测的试剂灵敏度不够。

 

当然,还有其他诸如环境因素、仪器问题等等的原因。要知道,任何检测手段都是有局限的,偶尔的例外并不是稀罕事。另外,因为目前对于新冠的了解不到位,检测不能一步到位,这也确实是现实。